热烈祝贺亚光多肽 合成新方法获国家专利授权！

     

       
        近日，我公司申请的“一种合成含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元的多肽的新方法”发明专利正式获得授权。该项专利应用于含有精氨酸以及衍生物的多肽的合成，公开了一种此类多肽的新的合成策略，在树脂上分别合成以精氨酸以及精氨酸衍生物为分割点的两段序列，而后将此两段序列连接而成制备目标多肽，这种方法有效抑制了天冬酰胺副反应的产生，提高了这类多肽的合成成功率。另外此专利在制备高纯度（纯度98%以上）的多肽产物时同样有很广阔的应用前景。
 

克服多肽固相合成中天冬酰亚胺副反应的新合成策略
A New Strategy for Overcoming Aspartimide Formation
During Solid Phase Peptide Synthesis

       天冬酰亚胺的形成是多肽固相合成中最常见的副反应之一，其发生机理是α-酰胺键中的氮原子与侧链β-羧基之间的关环反应。在目前广泛采用的Fmoc/tBu合成策略中这个问题尤其严重，这是因为在合成过程中去除氨基的保护基Fmoc时要频繁使用六氢吡啶（PIPE），而PIPE是一种仲胺分子，其碱性能促进此副反应的发生。形成的五元环天冬酰亚胺分子在碱性条件下非常容易发生消旋，而且其他亲核试剂也可进攻酰胺键发生开环反应，从而产生多种副反应产物^{[1, 2]}。例如，水分子进攻天冬酰亚胺产生β-天冬氨酸多肽；而PIPE导致的开环反应则产生α-和β-六氢吡啶多肽分子（如Figure 1所示）。这些副产物的性质与目标多肽分子较为接近，往往在纯化过程中很难将其分离开来。

  

Figure 1. Mechanism for aspartimide-related by-product formation.

        在合成中我们发现，含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元的多肽分子在合成过程中天冬酰亚胺副反应更为严重，得到粗肽的纯度较低，相关的副产物严重干扰反相高效液相色谱的纯化，不能制备出纯度高的目标多肽产物，甚至会发生得到的产物全部为天冬酰胺副产物的极端情况（Figure 2A）。我们认为，这种现象是由精氨酸的侧链胍基具有的碱性起的，其与碱性的六氢吡啶分子共同作用极大程度地促进合成过程中在相邻天冬氨酸上发生天冬酰亚胺副反应的可能，Figure 2C给出了甲基化精氨酸促进天冬酰亚胺副反应的机理。

Figure 2. MS result of crude peptide prepared by conventional stepwise SPPS (A) and by convergent peptide synthesis (B); C) Possible mechanism for aspartimide formation promoted by methylated arginine.

        针对这类特殊序列，中科亚光生物科技有限公司开发了一种简单可行的合成策略：在树脂上分别合成以精氨酸以及精氨酸衍生物为分割点的两段序列，而后将此两段序列连接而成制备目标多肽的策略，在这种方法中，分段合成^[3]使得天冬氨酸残基彻底避免了同时接触碱性的精氨酸胍基侧链和PIPE的环境，有效压制了天冬酰胺副反应的产生，提高了这类多肽的合成成功率，Figure 2B为采用新合成策略得到的粗肽质谱图，可以看到完全避免了天冬酰亚胺副产物的产生。值得一提的是，这种方法不仅能有效制备含有精氨酸衍生物单元的多肽，在制备高纯度（纯度98%以上）的多肽产物时同样有很广阔的应用前景。目前此专利技术已经获得国家知识产权局的授权。

专利（201110203211.1）说明书摘要：
       本发明关于一种制备含有天冬氨酸-精氨酸衍生物[Asp-Arg（X）]单元的多肽的新策略，尤其适用于由于精氨酸或精氨酸衍生物在合成过程中会促进天冬酰亚胺副反应的多肽序列，和用这种方法得到的产物。此方法包括一种利用片段缩合法优化多肽合成条件的策略，在这种策略中，多肽序列在Asp-Arg（X）处被分为两段且分别合成，其中包含Asp残基的一段在对酸高度敏感的2-氯三苯甲基氯树脂（CTC树脂）上进行合成，制备得到的全保护片段（氮端以及侧链均被保护）偶联到另一片段的Arg（X）的氨基上从而完成整个序列的合成。切割得到的粗肽通过常规的高效液相色谱法进行纯化，最终得到目标多肽的纯品。此方法有效压制了Arg（X）的碱性胍基侧链对天冬酰亚胺副反应的促进效应，极大提高了此类多肽的合成成功率以及最终产物的纯度。

参考文献：
1. Nicolas, E., Pedroso, E. & Giralt, E. “Formation of Aspartimide Peptides in Asp-Gly Sequences”, Tetrahedron Lett., 1989, 30, 497–500.
2. Janelle L. Lauer, Cynthia G. Fields and Gregg B. Fields, “Sequence Dependence of Aspartimide Formation during 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Solid-phase Peptide Synthesis”, Letters in Peptide Science, 1994, 1, 197-205.
3. Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio and Ernest. “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins” (1997). CRC Press, Boca Raton, New York.
4. Benz, H. “The Role of Solid-Phase Fragment Condensation (SPFC) in Peptide Synthesis”, Synthesis, 1994, 337-358.
 
 
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