合成多肽作为一类具有生物活性的药物，越来越多地用于治疗、预防和诊断疾病。其结构远比小分子化学药物复杂：具有与小分子多肽类似的肽链长度；存在二硫键连接、环化作用和分支作用所产生的二级结构；存在包括糖基化、酰化和烷化等形式的修饰作用。

为保证多肽的质量，必须对多肽药物生产工艺的全过程进行优化确认，其中包括建立稳定的生产工艺、可靠的制备和纯化程序，以及最终合成多肽的理化性质的确定和肽图分析等。

 

合成多肽的纯度检查

多肽纯度检查通常采用反相高效液相色谱（RP-HPLC），后来毛细管电泳（CE）也逐渐成为多肽药物分析的通用工具。由于分离机制不同，毛细管区带电泳（CZE）被认为是 RP-HPLC 的良好补充。CZE 是根据多肽片段的质荷比对其进行分离，而 RP-HPLC 是根据多肽的疏水性差异进行分离。疏水性差异小不能用 RP-HPLC 分离的多肽，可以根据质荷比的不同，用 CZE 分离。

 

合成多肽理化性质均一性的确定
 

目前，在对多肽药物理化性质均一性的分析方法中，序列分析（N/C 端）、肽图（尤其是大于 20 个氨基酸残基的肽类）、质谱（MS）分析以及氨基酸组成分析是使用最普遍的技术。
 

阐明多肽的结构、功能及对多肽进行深入研究都离不开对其一级结构、修饰位点等的了解。在蛋白水解酶（如胰蛋白酶）或化学试剂（如 BrCN）作用下，多肽可被部分裂解，对多肽片段混合物进行有效分离获得的反相色谱图即称为该肽的「肽图」。肽图法已成为反相高效液相色谱（RPLC）在多肽分析中最重要、最广泛的应用，已用于多肽药物的质量控制、疾病诊断等诸多领域。
 

反相肽图中常采用 C18 柱，由于酶消化产物含有大量疏水性不同的多肽片段，因此多采用较窄的梯度并延长梯度时间。由于蛋白质酶解产物中多肽片段分子量通常较小，借助反相肽图进行多肽分析可得到重复性好、分辨率高的结果。肽图分析有利于确定产物的一级结构，并有可能确定修饰应点。

 

合成多肽的有关物质检查
 

合成多肽的有关物质主要为合成过程带入的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物及聚合物等。
 

尽管目前合成多肽纯化工艺已经有了很大进步，但工艺杂质仍是合成多肽中有关物质的重要来源。多肽合成过程中的一些工艺杂质（如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换产物）与药物本身的性质可能非常近似，给纯化造成了一定困难。而且，多肽合成方法在很大程度上决定了终产品中杂质的性质，液相合成与固相合成所引入的工艺杂质不同，固相 Boc 法与 Fmoc 法所产生的杂质也有差异，甚至不同的保护/脱保护策略也会产生不同的工艺杂质。因此，在进行合成多肽的相关物质的研究时，必须结合自身的工艺特点对可能引入的杂质进行检测，建立有针对性的有关物质研究方法。同时，这也意味着，仿制多肽药物不能盲目照搬国家标准或已上市产品的有关物质检查方法，必须充分考虑到产品自身的工艺特点。
 

多肽降解产物、聚合物等是合成多肽有关物质研究的主要对象之一。影响合成多肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、β 消除及聚集等，在各种氨基酸中，Asp 和 Glu 易于发生脱酰胺反应（尤其是在 pH 值升高和高温条件下）；Met、Cys、His、Ser 及 Tyr 易于氧化，对光照也较为敏感；Asp 参与形成的肽链则易断裂，尤其是 Asp-Pro 和 Asp-Gly 肽键。由于一个多肽中通常会含有多种不稳定性的氨基酸残基或肽键，因此合成多肽降解机制和降解产物较为复杂。

 

合成多肽的二硫键分析
 

二硫键的硫基与多肽的生物活性密切相关。尽管目前可以用 X 射线晶体法及 NMR 技术测定小分子多肽的二硫键配对方式，但较复杂的多肽，二硫键的定位仍是采用生化、质谱及测序等联合方法来进行。
 

1. 部分还原测序法

先将多肽与还原剂三（2-羧乙基）隣（TCEP）快速反应，使其部分二硫键打开，然后用 HPLC 快速分离并迅速用烷基化试剂碘代乙酰胺对各组分进行烷基化，被烷基化的组分，再用 4-乙烯吡啶还原和烷基化，最后用 Edman 分析法测定其序列，从而测出不同烷基化的 Cys 的位置。一般需测出两个衍生物才能确定二硫键的配对方式。该方法的关键是控制好第一步烷基化条件，TCEP 可在酸性条件下还原，有效减少二硫键的交换。
 

2. 酶解-MS 法

该方法是用专一性酶将多肽在特定位置切断，然后用 HPLC 纯化各裂解片段，作 MS 测定，根据分子离子峰值推测可能的片段，然后将各片段组合分析，推断结构。该方法有时只能判断一种可能的连接方式，还需半还原标记测序或半还原后测 MS，才能分析出全面的二硫键连接方式。使用的酶一般为胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和嗜热芽孢菌蛋白酶。

3. 酶解-测序法

基本流程同酶解-MS 法，所用的酶较多。测序量较大。

以上三种方法，部分还原测序法较为简便。实践中，酶解、测序和质谱需综合运用，方可更好地检测二硫键的配对方式。

 

合成多肽非对映异构体杂质的检查
 

氨基酸多为手性分子，在多肽合成过程中不可避免地存在消旋化的可能。由于多肽药物的生物活性与其立体构型密切相关，因此有必要对多肽合成中的氨基酸消旋化以及非对映异构体杂质进行研究和控制，而非对映异构体杂质的色谱行为多与主成分非常接近，常规的有关物质检查方法通常很难达到检测要求。
 

多肽合成的消旋机制

多肽合成中氨基酸的消旋化机制主要有以下两种：

直接烯醇化机制   在多肽缩合条件下，碱催化的烯醇化机制起重要作用，消旋速率依赖于活化羧基 α 质子的酸性、溶剂、温度及碱的化学性质，氨基酸 α 质子的酸性取决于取代基的性质。

5(4 H)-噁唑酮机制   5(4 H)- 噁唑酮 (D/L-4) 由氨基酸活化产生，是多肽合成的重要活性中间体，同时，由于其立体化学不稳定，也是氨基酸消旋化的主要原因。

非对映异构体杂质研究及控制

加强起始物料的质控   合成多肽的各手性中心直接来源于合成起始的各种保护氨基酸，因此应注意对合成起始原料光学纯度的质量控制。目前国内起始原料的内控标准中通常仅对比旋度进行控制。由于比旋度检查方法在专属性、灵敏度方面的限制，往往不能有效地控制氨基酸的光学纯度，对比旋度数值较小的保护氨基酸更是如此。采用专属性强的手性 HPLC 对起始原料的光学纯度进行控制相对较好。

注意工艺过程的控制   多肽合成中肽键的形成与消旋是相互竞争的，因此应结合消旋机制，注意氨基酸侧链保护基及缩合剂的选择，对投料比及反应条件进行考察，尽量降低消旋程度。肽链中含有易消旋的氨基酸时，更应注意对合成 T. 艺的研究，可考虑在易消旋氨基酸的缩合步骤，另采用 D 构型氨基酸制备差向异构体对照品，通过合适的色谱条件检测所选工艺条件下氨基酸的消旋程度，对氨基酸缩合工艺优化改进。据报道，在对四肽片段（NH2-His-Gly-Glu-Gly-COOH）固相合成中 His 缩合步骤的消旋情况的研究中，通过采用高效的缩合试剂、增加 Fmoc-His（Trt）-（）H 的投料量的方式，可加快肽键缩合速度，降低 His 消旋风险，His 的消旋程度可降低 50% 左右。

选择合适的检测方法   与其他合成药物的有关物质研究相同，合成多肽中非对映异构体杂质也可采用 HP1.C 检查，最常用的是 RP-HP1C，采用 C18、C8 或 C4 柱等。但随着肽链的增长，少数氨基酸消旋产生的非对映异构体杂质采用 RP-HPI.C 常常无法有效检出，可根据产品的性质尝试考察其他不同原理的色谱系统，如离子交换色谱、毛细管电泳法等。某多肽创新药物（30 肽以上）在研发的早期，采用 RP-HPIC 测定样品纯度为 97.8%、而采用强阳离子交换色谱法测定纯度仅 88.0%，其中 His 差向异构体杂质高达 9.8%，后经制备工艺的改进优化，His 差向异构体杂质得到了良好的控制。

Goodlett 等采用 HPLC-MS 对多肽的光学纯度进行测定。先将多肽在 DCl/CD3COOD 中水解，再采用 N-a-（2，4-二硝基-5-氟苯基）-L-丙氨酰胺对水解后的氨基酸进行衍生化，使用普通的 RP-HPI.C 或 GC 即可将衍生化后的 D 构型和 L. 构型氨基酸分离，从而可检测多肽中消旋氨基酸的含量。使用氘代试剂进行水解，产生的消旋氨基酸的 a 位质子为氘，通过 ESI-MS 检测可将多肽中的消旋氨基酸与水解过程中产生的消旋进行区分。此方法的优点在于专属性良好. 且应用范围广泛，方法建立后可对各种多肽药物进行检测。国外研发机构常使用类似方法控制合成多肽药物的光学纯度，并且可以此为参考优化制备工艺。

合成多肽人为修饰的检测
 

一般认为，即使是从非常均一的同种多肽开始，人为修饰也能导致均一或非均一的最终产品，这与修饰位点的数目有关。确定同质性或异质性的出发点可能采用不同的色谱方法，并根据所需测定的修饰方法进行调整。重要的是能维持和证明批与批之间的一致性。

合成多肽生物学效价的测定
 

一般的合成短肽结构简单，没有空间构象的影响，可以不设活性效价检测项目。也有一些合成多肽具有可测定的生物学或免疫学特性。在某些情况下，效价测定可能是对稳定性评价的一个较好的指标，也可采用与稳定性相关性更好的新分析方法。

。。。。。。


多肽合成选中科亚光！常规肽、修饰肽、多肽原料药，欢迎咨询。010-62810190/marketing@scilight-peptide.com